邱录贵教授团队最新研究发表，多发性骨髓瘤克隆演变研究渐成体系

邱录贵教授团队最新研究发表，多发性骨髓瘤克隆演变研究渐成体系深圳茂业 作者：聊聊血液 研究亮点 1.通过单细胞水平的QM-FISH检测，绘制多发性骨髓瘤的克隆进化树 2.在大规模临床分析中探索了不同克隆演变的预后价值 单细胞分析在描绘亚克隆精确发育

深圳茂业

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作者：聊聊血液

研究亮点

1.通过单细胞水平的QM-FISH检测，绘制多发性骨髓瘤的克隆进化树

2.在大规模临床分析中探索了不同克隆演变的预后价值

单细胞分析在描绘亚克隆精确发育及探索微小多样化方面具有极高的价值，肿瘤内异质性和克隆演变机制对研究肿瘤患者的耐药和复发进展具有重要意义，但在多发性骨髓瘤领域，有关肿瘤内异质性和克隆演变的探索多限于群体肿瘤水平。

此外，多发性骨髓瘤(MM) 肿瘤生物学特性和临床预后都具有较高的异质性，是一个探索克隆进化驱动的疾病进展的一个理想的模型。而过去的研究大多采用模拟计算的方法，通过检测批量样本中携带每种变异的肿瘤细胞的比例，来推断克隆驱动事件的顺序，并构建肿瘤的系统发育树。但这些基于群体肿瘤水平的研究同样难以准确定义和追踪肿瘤内较小亚克隆，且在推测肿瘤遗传学事件发生先后顺序方面存在局限性。

中国医学科学院血液病医院（血液研究所）邱录贵教授团队通过多基因定量荧光原位杂交检测（QM-FISH）方法，在单细胞水平绘制每例患者的亚克隆的系统发育树，并探索患者复发进展时的克隆演变模式及临床指导意义，本研究近期发表于《blood advances》杂志。此外，该项研究于2021年第18届国际骨髓瘤大会（IMW）入院口头汇报，并于大会获得 “IMS Young Investigator Award” 奖项。

方法

患者和样本

研究对57例MM患者的129个初诊/复发配对的纵向骨髓标本，在单细胞水平上进行多基因定量荧光原位杂交检测（QM-FISH），绘制每例患者的亚克隆的系统发育树，并评估患者复发进展时的克隆演变模式。为进一步验证QM-FISH在检测肿瘤内克隆的可行性，并验证不同克隆演变模式对患者生存预后的影响，本研究扩大样本量，选取188例MM患者的初诊/复发配对样本，通过传统FISH（cFISH）检测关键细胞遗传学异常（13q-，1q21+，17p-，IGH易位）。

#使用的标本为骨髓，QM-FISH探针有del(17p) (TP53)、del(13q) (RB1)、del(16q)(CYLD)、del(11q) (cIAP)和 1q21gains (CKS1B)。

*高危细胞遗传学异常定义为del17p、t(4;14)或t(14;16)。主要终点为无失败生存期FFS和总生存期OS

结果

克隆异质性和MM中主要细胞遗传学异常的发育树

作者对57例MM患者的129个初诊/复发配对的纵向骨髓标本，在单细胞水平上进行QM-FISH检测。所有患者均有诊断和复发时的骨髓标本，其中12例患者有超过2个时间点的细胞遗传学评估（包括二次复发或治疗后标本）。

所有患者首次采样后，中位检测出4个（范围2-6）亚克隆。作者将20号患者进行举例，对患者的200个浆细胞进行QM-FISH检测，共测出5个细胞遗传学异常，见下图A。其中最常见的是13q- (192/200, 96.0%)，继之1q21+ (126/200, 63.0%)，11q- 和16q-为亚克隆水平（下图B）。

同一标本中≥2个细胞遗传学异常共存这一情况非常普遍。例如，如果标本中有2个细胞遗传学异常，一个是异常A，另一个是A和B，则表明异常A可能早期遗传学异常事件，而B可能是后续的乘客事件。因此作者推断，异常A的发生早于异常B（下图C）。克隆内遗传多样性是MM患者的共同特征，75.4%（43/57）的MM患者在初诊时就存在3-4个亚克隆（下图D），13q-/1q21+可能是MM较早期获得的遗传学异常（下图E），初步研究结果表明遗传学事件发生的先后顺序可能会影响疾病的预后，如果 1q21扩增是在13q缺失后作为乘客事件出现，而不是作为初始驱动遗传学事件，则该疾病似乎更具侵袭性（从采样起，中位OS分别为71.2和32.9个月，P=0.010）（下图F）。

QM-FISH确定的4个克隆演变模式

作者通过比较复发前后的克隆变化，把MM复发进展分为四种克隆演变模式（稳定型、分化型、分支型和线性型）。本研究中，57例患者中有31.6%为克隆稳定型（复发时无新发克隆、无原有亚克隆消失），21.1%为分化型（诊断时的优势克隆消失或减少，而复发时某克隆生长为优势克隆），15.8%为分支型（复发时出现≥1个含有新的细胞遗传学异常的克隆，且出现原有克隆消失），31.6%为线性型（复发时获得≥1个含有新的细胞遗传学异常的克隆）。

从下图看出，细胞遗传学异常的4种克隆演变模式对患者生存也有明显影响。克隆稳定型患者的总生存和复发后生存时间均显著优于其他三个模式的患者，稳定型、分化型、分支型和线性型的中位OS分别为71.2、39.7、35.2 和25.5个月（p=0.001）。但4种模式之间采样间隔不存在差异(首次FFS, P=0.131，下图A)，因此，生存差异可能更多由首次复发后较短的FFS所驱动（二次FFS, P<0.001，下图B)。

扩大队列用cFISH进行验证

作者首先评估QM-FISH所检测细胞遗传学异常（cytogenetic abnormalities，CA）的精确度。结果发现，cFISH和QM-FISH在细胞遗传学异常的细胞分数上高度一致 (P<0.001)，见下图A。这一结果表明，QM-FISH可以在单细胞水平同时检测到多个细胞遗传学异常，而不会降低识别准确率。

此外，作者根据cFISH结果将患者分为3组：未获得新的细胞遗传学异常且无明显的细胞遗传学异常比例的改变(n=22, 39%)；无新的细胞遗传学异常但细胞遗传学发生的比例有明显改变(n=13, 23%)；复发时存在新的获得性细胞遗传学异常(n=22, 39%)。结果发现，第一组22例中有18例（82%）重新划分为QM-FISH的演变稳定型，而C组中cFISH评估的22例中有16例（73%）划分为线性型，5例（23%）划分为分支型，见下图B。

基于上述结果，作者做出结论，cFISH和QM-FISH在评估MM细胞遗传演变模式上具有高度一致性和互补性。

随后作者将研究队列进行扩展，以进一步探索细胞遗传学评估的预后价值。总的来说，188例MM患者经cFISH进行了至少2次细胞遗传学评估，两次检测的中位间隔时间为19个月（范围2-76个月）。

诊断时33%的患者为细胞遗传学高危，复发时则达到49%（下图A），而这一结果多归因于新出现的del(17p)，并且复发时检测到的del(17p)多为优势克隆（high clone size）。此外，复发时del(17p)比例>50%的患者预后最差，而其他结果曲线无明显差异，并且这一结果与作者之前的研究也一致。

生存方面，不论高危遗传学异常（high-risk aberrations）是诊断时早期出现，还是复发后晚期出现，患者的生存预后均较差（上图B、C）；并且诊断时高危异常的预后作用还会随着时间推移而减弱(从诊断开始计算的生存期HR=1.79,P=0.002;从复发开始计算的生存期HR=1.55,P=0.026; 上图B、D)；复发后存在高危异常(HR=2.07; 上图E)对从复发后生存时间的影响大于初诊时存在高危异常(HR=1.55; 上图D)，因此复发后的高危遗传学异常比初诊时更具预测意义，研究强调了MM复发进展后重复进行细胞遗传学评估的重要性；此外，对于诊断时存在原发高危异常的患者和复发后演变为高危异常的患者，两组OS无统计学差异(P=0.800; 上图F)。上述结果证实，细胞遗传学评估结果重复可使患者受益，特别是可以预测复发后的生存。

1q21克隆演变

作者先前曾报道了初始诊断时1q21扩增对生存的影响，也在本次研究中评估了随访期1q21 扩增拷贝数或克隆大小(clone size)的预后价值。

本研究发现，复发时存在≥3个1q21拷贝的患者高于诊断时(69% vs 55%, P=0.004)。

作者根据2个采样时间点之间1q21 扩增拷贝数和克隆大小的改变情况，将患者分为6组（下图A）。其中，两个时间点均无1q21扩增的患者（B组），与初诊时存在1q21扩增但复发时明显下降或丢失的患者（A组），它们的预后均较好 (复发后FFS 18.1个月vs 27.8 个月, P=0.469)，而两个时间点均存在1q21 扩增的患者，和伴克隆大小增加的患者（C、D组），其预后差于A和B组(复发后FFS分别为12.4个月和10.5个月, P<0.05)，剩下的患者分别为复发时1q21拷贝数增加，和复发时新发1q21 扩增的患者，他们的预后最差(E、F组，复发后FFS分别为6.7个月和8.9个月; 见下图B)。

此外，6组在2个采样时间点之间的时间间隔相似，但1q21 gain不同的演变模式可以明显区分总生存期（OS）和复发后生存期(P>0.001;见下图C、D)。

从上图可以看出，复发后1q21扩增克隆大小和拷贝数变化具有预后价值：19%患者在复发时新检测出1q21扩增，另有11%的患者在初诊/复发均有1q21扩增，且1q21的拷贝数在复发时增加（例如从3拷贝增加到4-5拷贝），这些患者的预后明显差于其他患者。本研究是首次详细探索MM复发进展时1q21扩增大小和拷贝数改变是如何影响患者生存预后。

讨论

虽然复发患者的治疗选择得到了明显增加，但MM仍是无法治愈的疾病。克隆演变是导致肿瘤治疗棘手的最根本的原因之一，不同研究也证实了MM可以通过获得连续的基因打击（genetic hits）进行多级进展，继而发生克隆演变。但因为连续样本完整采集存在困难，既往研究多无法收集足够的样本量和临床数据，因此无法准确评估多发性骨髓瘤的克隆演变特征，且无法评估克隆演变对临床预后的影响意义。

基于诊断时的细胞遗传学结果给予患者风险调整的治疗策略，这已经越来越成为当代临床实践中的治疗基石。然而，即使学者已发现了相当数量的细胞遗传学异常，其中仅有少数是MM发生和临床预后的决定因素。因此，本文作者选择了5个重要的遗传学事件，包括del(17p)、del(13q)、 del(16q)、 del(11q)和 1q21 gain，去追踪疾病进程中起决定性作用的异常及其演化过程。

作者认为，FISH在主要标志物检测方面具有简单和可靠的双重特点，仍是评估肿瘤标本中拷贝数改变最快速、精确的工具。其中传统FISH（cFISH）是MM中识别细胞遗传学异常和指导预后分层的金标准，但它也有缺点，即无法同时检测1或2个细胞遗传学异常，此外cFISH检测时如果使用多探针，信号弱、丢失杂化信号、背景高噪音等情况也会导致信号/噪音比相对较低。因此，不同学者都在探索QM-FISH技术，用它来检测单个细胞的5个细胞遗传学异常情况，其优势是可以增强分辨率和高信号/噪音比，且无损核形态。

本研究QM-FISH结果直接证实了单个细胞标本中的不同克隆存在关联性，且在单细胞水平找出了细胞遗传学异常发生的时间顺序。多数患者在初诊和复发时均有单事件和多事件亚克隆共存的情况，这表明多事件亚克隆在发育过程中并没有被优势克隆彻底清除。

此外，本研究也表明，亚克隆发生的动力学模式是基于每个标本初诊时的克隆进化树（ancestral architecture）。通过初诊/复发配对的纵向QM-FISH，本文作者探索了多发性骨髓瘤克隆演变的模式，发现在1/3的MM患者中表现为初诊时肿瘤存在的基因修饰随着时间推移保持稳定，克隆稳定是最常见的演变模式，这些患者在进展后挽救治疗更有效，且在后续疾病进程中可以获得相似或稍差的缓解。除了克隆稳定型，还有3个克隆竞争模式，那就是分化型、分支型和线性型。

分化型演变模式的克隆结构较稳定，但亚克隆的相对比例发生剧烈改变，证明诊断时存在的微小耐药克隆经过治疗选择，可在复发后扩大为优势克隆。线性型和分支型患者可获得新的遗传学异常，其中线性型演变模式在近期二代测序出现后得到已经充分证明，其克隆多为不稳定，且在强化化疗下，携带新异常的新克隆可替代原有克隆。分支型克隆的患者中，部分敏感克隆和其他亚克隆同时消失，并获得新克隆。克隆演变是生存期的不良预后因素，而克隆稳定患者的预后一般较好。

cFISH 和QM-FISH识别出的克隆演变比例相似(61% vs 68%)，可见它们在细胞遗传学演变模式的评估方面有高度一致性，但cFISH的缺点是无法有效区分线性型和分支型演变路径。此外，cFISH无法准确呈现克隆的内在多样性和演变架构，且在检测微小亚克隆（<10%)的灵敏度方面不如QM-FISH，而QM-FISH可以更好的确认克隆架构和追踪克隆密度随时间的变化情况。

1q21扩增是多发性骨髓瘤最常见的细胞遗传学异常，尤其是亚洲人群中。然而，虽然1q21 扩增一般认为是MM的不良预后标志物，但复发时1q21拷贝数改变的预后作用仍有争议。

作者曾报道，1q21 >3个拷贝数的患者PFS和OS与3个拷贝数的患者相似，也有其他研究与之结论一致。但也有研究者抱有相反观点，认为1q21 >3个拷贝数较3个拷贝数是不良因素。作者在本研究中首次评估了1q21克隆演变的影响，发现复发时1q21 扩增克隆大小降低的患者预后居中，而复发时1q21拷贝数增加和发现新1q21扩增的患者预后非常差，可见疾病进展过程中1q21扩增的克隆演变对生存期有明显影响。

总的来说，QM-FISH可以在单细胞水平上绘制多发性骨髓瘤的克隆进化树，对判断遗传学事件发生的先后顺序和克隆演变规律很有意义。克隆演变模式对生存预后有重要意义，MM复发后出现高危细胞遗传学异常与较短的复发后生存相关。对于复发后生存时间的预测，复发后的高危遗传学异常比初诊时更具预测意义（HR=2.07 vs.1.55）。研究强调了MM复发进展后重复进行细胞遗传学评估的重要性，并提出单细胞QM-FISH技术是研究MM克隆演化的一个有效手段。

本研究团队在骨髓瘤克隆演变领域同步展开了多项研究，在去年的leukemia杂志上团队发表近期研究结果，通过对治疗后残留浆细胞的遗传特征分析，首次系统揭示了不同治疗选择压力下细胞遗传学异常的克隆演变模式，根据复发时的纵向细胞遗传学研究发现，患者细胞遗传学异常的演变呈连续进程，治疗后残留浆细胞的遗传学检测一定程度上可以预测患者复发时的进化模式，并预测患者生存预后。后续关于MM续贯样本的单细胞测序相关研究也正在进行中。

MM是一个不可治愈的肿瘤，克隆演变是MM进展的内在动力和复发的根本原因，研究团队多年来致力于对MM克隆演变的研究，以期更好地认识MM的生物学特点，为诊疗及预后评估提供新思路。

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